基因工程实验资料

发布于:2021-09-17 06:23:23

1.动物细胞 DNA 提取原理是什么? 答:先用 SDS 裂解细胞,使染色体离析,蛋白质变性,释放出核酸。然后用等体积酚/氯仿 /异戊醇抽提,使蛋白质变性沉降到酚与水相的界面,DNA 则留在水相中,离心后在上清液 中加入醋酸钠和两倍体积无水乙醇,除去多糖物质和沉淀 DNA,然后离心后沉淀用 70%乙 醇洗涤,最后用 ddH2O 溶解沉淀 DNA,-20℃保存。 2.DNA 提取中用到了哪些试剂?有什么作用? EDTA:二价金属离子螯合剂,螯合 Mg2+,抑制 DNA 酶活性。因为 Mg 离子是 DNA 酶的辅 因子。 SDS:一种阴离子去污剂,在高温(55℃—65℃)条件下能裂解细胞,使染色体离析,蛋白 质变性,释放出核酸。 酚:使蛋白质变性。 氯仿:作为除杂剂,除去糖、脂等杂质;加速有机相与液相分离;抽提核酸溶液中残留的酚。 乙丙醇:作为消泡剂;降低 DNA 的水溶性,让 DNA 从溶液中析出;有利于分层,使离心后 的上层含 DNA 水相,中间的蛋白质相及下层有机溶液相维持稳定。 无水乙醇:降低 DNA 的水溶性,沉淀 DNA。 醋酸纳:调 PH,中和 Tris-Buffer,形成中性环境,利于 DNA 沉淀。 Tris-Buffer(PH8.0):提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏。 70%乙醇:清洗溶液中离子及其他杂质。 NaCl:提供高盐环境,使 DNA 溶解于液相中。 2.有机溶剂使用注意事项? 答:①有机溶剂的容器,不论是否在使用中,都应随手盖紧。 ②尽可能在通风位置工作,以避免吸入有机溶剂的蒸汽。 ③尽可能避免皮肤直接接触。 3.PCR 原理? 答:将目的基因 DNA 在高温(94℃)下解链成为单链模板;人工合成的一对与目的基因两侧 序列相互补的寡核苷酸引物在低温(40~60℃)下分别与变性的目的基因片段两侧的两条链 的部分序列互补结合;在中等温度(65~75℃)下,由耐热的 DNA 聚合酶(Taq 酶)将 dNTP , , , 中的脱氧单核甘酸加到引物 3 -OH 末端,并以此为起点,沿着模板以 5 →3 方向延伸,合 成一条新的互补链。 4.PCR 类型?反转录 PCR 怎么做的? 答:反向 PCR、巢式 PCR、锚定 PCR、数字 PCR、RT-PCR、实时荧光定量 PCR、免疫捕捉 PCR 等。 RT-PCR 的原理:提取组织或细胞中的总 RNA,以 ployA(A)+选择性 RNA 为模板采用 oligo(dT)、随机引物或基因特异性的引物 GSP 经反转录酶的作用从 RNA 合成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增,获得目的基因或检测基因表达。 5.PCR 影响因素? 答:引物;模板;DNA 聚合酶;Mg2+;底物;反应缓冲液。 6.PCR 体系有什么物质?作用? 答:①引物:是两段与待扩增目的 DNA 序列侧翼片段具有互补碱基特异性的寡核苷酸,使 , DNA 聚合酶以其 3 -OH 末端为起点合成互补链,决定了特定基因的扩增。 ②模板:提供 DNA 复制的模板,模板 DNA 可以是单链分子,也可以是双链分子。 , ③TaqDNA 聚合酶:将 dNTP 中的脱氧单核甘酸加到引物 3 -OH 末端,并以此为起点,沿 , , 着模板以 5 -3 方向延伸,合成一条新的互补链。 ④底物 dNTPmix:4 种脱氧核苷酸,提供 PCR 反应的原料和能量。 ⑤反应缓冲液:反应缓冲液一般含有 Tris-HCl、KCl 和适当的 Mg2+。Mg2+是 DNA 聚合酶 的激活剂,Tris-HCl 起缓冲作用,KCl 有利于引物的退火。 7.怎样提高 PCR 产物的特异性? 引物:a.典型的引物 18 到 24 个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存 在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于 24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。较 长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产 量。 b.选择 GC 含量为 40%到 60%或 GC 含量映像模板 GC 含量的引物。 c.设计 5'端和中 间区为 G 或 C 的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。 d.避免引 物对 3'末端存在互补序列,这会形成引物二聚体,抑制扩增。e.避免 3'末端富含 GC。设计 引物时保证在最后 5 个核苷中含有 3 个 A 或 T。f.避免 3'末端的错误配对。3'端核苷需要同 模板退火以供聚合酶催化延伸。 g.避免存在可能会产生内部二级结构的序列,这会破坏引 物退火稳定性。 Mg2+:浓度通常为 0.5—2.0mmol/l,过高或过低均影响产物的特异性。 模板:模板量应适宜,过量则可能增加非特异性。 延伸时间:应适宜,时间过长会导致产物非特异性增加。 循环次数:一般为 30 个(25—30 个)周期,如果循环次数过高,会增加非特异性产物及其复 杂度。 8.PCR 都有哪些酶可以用? 答:TaqDNA 聚合酶;TthDNA 聚合酶;Vent 聚合酶;PfuDNA 聚合酶。见实验书 69 页。 9.T4 DNA 连接酶连接的原理? 答: T4 DNA 连接酶作用机制: 酶先与 ATP 形成酶-AMP 共价复合物, 再与 DNA 作用、 AMP , , , 转移至 DNA 缺口 5 -磷酸基上形成焦磷酸键而活化 5 -磷酸基,然后再与 3 -羟基形成磷酸 酯键,完成连接过程。 10.PCR 产物与 T 载体怎样连接的? 答:PMD18-T 质粒 0.5uL,PCR 产物 4.5uL,2× solution(含 T4DNA 连接酶)5uL,混匀后 16℃水浴过夜。 11.DNA 用试剂盒是怎么回收纯化得到的? 答:依据吸附柱中的硅胶膜在高盐浓度下特异性吸附 DNA,在低盐浓度下可被洗脱的原理。 按照 100mg 胶块加入 700uL 溶胶液的比例,55℃溶胶。将融化的胶溶液转移到吸附柱中, 离心后倒掉收集管中的废液, 将吸附柱放入同一收集管

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